Powinna być zapewniona temperatura środowiska reakcji zbliżona do temperatury wewnętrznej ciała człowieka (taka sama, jak temperatura ciała człowieka), czyli ok. 37°C (ludzka pepsyna jest aktywna / działa najlepiej w temperaturze ciała ludzkiego).

Sposób spełnienia warunku: umieszczenie probówek w łaźni wodnej w temperaturze 37°C.