W komórkach zwierzęcych acetylo–CoA powstaje w reakcji pomostowej, czyli oksydacyjnej dekarboksylacji pirogronianu oraz w wyniku β-oksydacji – procesu utleniania kwasów tłuszczowych. Procesy te zachodzą w matriks mitochondriów, gdzie acetylo-CoA jest substratem cyklu Krebsa.